“黄州萝卜”良种选育及绿色栽培技术集成与示范应用

一、成果简介

项目主要通过种质收集评价、EMS诱变改良、基于特异SSR分子标记的纯度鉴定、特异成分分析及适用于黄州萝卜的绿色栽培等技术方案，充分挖掘、改良和推广了湖北省地方特色蔬菜-----“黄州萝卜”。基于有别于传统杂交配组的化学诱变及小孢子培养技术有效提纯改良“黄州萝卜”特异种质等，上述种质改良技术极大加速“黄州萝卜”种质改良过程。经该育种技术改良的“黄州萝卜”生长势强，整齐度高，纯度高达90%。基于特异SSR分子标记开发了“黄州萝卜”纯度鉴定技术，为区分与纯化 “黄州萝卜”提供了有效的鉴定手段并获得了国家发明专利。规范黄州萝卜栽培繁种技术，特别是在栽培过程中增加高分子吸水性树脂材料(CrossLinked Polyacrylamide，交联性丙烯酰胺)有效效降低畸根率， “黄州萝卜”畸根率从29.88%降低到2.39%。结合肉质根不同发育时期的转录组及代谢组挖掘了“黄州萝卜”的特异成分及关键基因，从营养成分及差异基因上支撑“黄州萝卜”的特异种质。

二、技术创新

创新一：研基于EMS（甲基磺酸乙酯）化学诱变和小孢子培养结合的“黄州萝卜”良种选育方法。

介绍：借助EMS诱变剂的诱变效应，在黄州萝卜及短叶-13等萝卜品系种质创新中构建了适合萝卜种质创新的技术体系。0.5%（V/V）EMS诱变“黄州萝卜”最为合适，诱变后产生较为广泛的变异类型,再经过多年筛选后表型稳定。目前经EMS诱变萝卜后已获得肉质根根形、叶形、花期、花粉育性、角果果型等变异材料，为萝卜农艺性状发育机理研究及新品种选育提供了丰富的实验材料。经前期小孢子离本培养条件摸索，选取EMS诱变后的品系2至3 毫米花蕾在B5培养基中用无菌研棒碾压花蕾，挤出小孢子，转移小孢子至2毫升NLN培养液，先在33摄氏度恒温箱中热激处理1天，再转入之至25摄氏度恒温培养箱中静置暗培养，待出胚后转移出即可。“黄州萝卜”经上述条件进行小孢子培养后获得单倍体的纯化植株。“黄州萝卜”单倍体植株为后期种质改良提供难得种质材料。诱变获得的变异“黄州萝卜”再经单倍体纯化之后的新“黄州萝卜”经实验比较及种植户评价，一致认为其生长势强，整齐度高。“黄州萝卜”平均产量为4100kg/667m2，肉质根上部突出地面部分保持绿色，整体根形为斛斗形，根形匀称，纯度达90%以上，肉色白亮耐糠心（图1）。并制订相关栽培规范和出版生产方法专著。

图1. “黄州萝卜”（左）及种植情况（右）和专著（下）。

创新二：3碱基重复类型SSR分子标记的“黄州萝卜”鉴定方法

介绍：结合不同品种萝卜（包括黄州萝卜、南畔洲萝卜、南乡萝卜、夏抗40天、双红萝卜、红宝、短叶-13、七叶红、红庙萝卜、春白一号、脉地湾萝卜、武青一号等）的基因组分别使用25对仅含3碱基重复类型的特异萝卜SSR分子标记引物进行PCR扩增，结果发现3碱基重复类型的特异萝卜SSR分子标记引物中R102和R112两引物对能够特异性鉴定所检测样品是否为黄州萝卜。R102通过PCR扩增及PAGE检测条带，发现在黄州萝卜与其它萝卜等存在明显差异，唯有黄州萝卜在目标条带227bp处扩增出不同于其它萝卜的特异条带，而其它萝卜在227bp处没有扩增出任何条带，因此R102标记可作为鉴定出黄州萝卜的特异标记（图2）。R112通过PCR扩增及PAGE检测条带在黄州萝卜及其它萝卜等存在明显差异，上述萝卜都能够扩增目标条带（251bp），但唯有黄州萝卜在400bp处扩增出不同于其它萝卜的特异条带，而其它萝卜在400bp处没扩增出任何条带，因此R112标记可作为鉴定出黄州萝卜的特异标记。

图2.R102号SSR分子标记引物所扩增的条带。

因此，结果表明本研究首次开发出适用于“黄州萝卜”特征与纯度检测的特异SSR分子标记R102和R112。经纯度鉴定后，为大面积“黄州萝卜”提供种质检测保障，目前已授权国家发明专利（图3）。

图3.开发SSR分子标记用于黄州萝卜鉴定的国家发明专利

创新三：高纯度“黄州萝卜”特异成分挖掘

介绍：采用液相色谱-质谱技术（LC-MS/MS）对不同发育时期的“黄州萝卜”萝卜肉质根进行非靶向代谢组学分析，结果在正离子模式下共注释得到1874种代谢物，其中具有鉴定信息的代谢物数量为350种，主要包括2种萜类及聚酮类化合物代谢物、2种辅助因子和维生素代谢物、3种碳水化合物代谢物、5种其他氨基酸代谢物、5种核苷酸代谢物、10种脂质代谢物、12种氨基酸代谢物及15种生物合成相关的其他次级代谢物等。

通过对“黄州萝卜”肉质根发育三个不同时期（即生长3周的破肚期,生长6周的膨大期和生长9周的成熟期）的可溶性蛋白、可溶性糖、维生素C等营养成分进行检测分析可知，“黄州萝卜”肉质根的可溶性糖含量不断增加，并于膨大后期陡然提升；可溶性蛋白含量随着肉质根发育逐渐上升，至膨大期蛋白质含量达峰值，在向成熟期过渡过程中又呈现下降趋势（图4）；维生素C的含量变化趋势和蛋白质的含量变化规律类似，从破肚期至膨大期升高达峰值后再于成熟期呈下降状态。”黄州萝卜”肉质根中特殊营养成分的筛选及比较分析为确定”黄州萝卜”肉质根采收期、深度开发及后期加工提供有效的参考依据。

图4.可溶性蛋白在“黄州萝卜”肉质根发育三个不同时期含量比较。

另有检测发现，新改良“黄州萝卜”干物质含量在参试萝卜品种之中最高（表1），高达11 g/100g，表明其非常适合做腌制品。

表1.几种萝卜肉质根干物质含量比较

创新四：高纯度”黄州萝卜”重要功能基因的挖掘

介绍：针对“黄州萝卜”、“潍县青萝卜”和“南乡萝卜”三个不同发育时期的肉质根进行有参转录组分析，结果显示1117个差异基因在萝卜肉质根不同发育阶段均表达上调，三个萝卜品种所有发育时期均表达上调的378个差异基因中包括1个糖转运体、1个黄酮醇合成相关基因、1个类脂肪酸蛋白合成相关基因、8个参与果胶合成和降解相关基因、2个类生长素响应蛋白表达基因、4个MYB转录因子、4个WRKY转录因子、3个bHLH转录因子、3个乙烯响应转录因子、3个热刺激转录因子等。上述差异基因表达数据与“黄州萝卜”萝卜肉质根表型的结合将为解析“黄州萝卜”肉质根果胶、可溶性糖和次生代谢物积累以及激素和环境刺激响应的分子机理提供理论依据。图5显示了“黄州萝卜”与其它萝卜肉质根差异基因分布及肉质根果胶关键基因RsGATL筛选情况，其在“黄州萝卜”肉质根中表达明显升高。

三、应用示范

主要发现点相关研究结果共发表论文15篇，其中SCI收录5篇，出版学术专著1部，获批国家发明专利3项，黄冈市自然科学优秀学术论文奖1项。本项目坚持以实际应用和服务社会经济效益为出发点，实行边研究边示范边推广的转化策略，在黄州区及周边区域进行大面积的推广示范，得到当地种植户好评，取得较好的经济效益。“黄州萝卜”高效示范推广面积近5000亩。连续三年进行技术的普及与培训，成果试验与推广期间接受了大量的来函来电，进行了咨询与指导，开展了3 期培训班，培训累计达200 多人次。并在学校的支持下出版专著《黄州萝卜优质高产栽培生产技术》，印数 2000 册。成果应用推广 2019至 2022年累计新增了1012 万元的直接经济收入。